2_ Yksityiskohta tauriinin volyymille herkästä vapautumisesta

Tauriinin säätelyn toinen pääkeino on tauriinin vapautuminen solusta ulos (volyme-sensitive taurine release)

Lambert jakaa tämän asian käsitelyn seuraaviin alaotsikoihin ensin yksityiskohtia ja osatekijöitä selvittäen :

1. Regulatory volyme decrease (RVD): Swelling induced taurine release Solun turpoamisen aiheuttama tauriinin vapautuminen.
2. Swelling -induced activation of PLA2. Solun turpoamisen aiheuttama PLA2 entsyymin aktivoituminen.
3. Arachidonic acid: Direct effect of fatty acid. Arakidonihappo ja rasvahappojen suora vaikutus.
4. Lipoxygenase products as second messengers. Lipoxygenaatiotuotteen toisiolähetteinä.
5. Ca++ and calmoduliinin- Mikä osa on kalsiumjonilla ja kalmoduliinilla.
6. Role of endogenous and exogenous ATP. Endogeenisen ja exogeenisen ATP:n osuus.
7. Reactive oxygen species and tyrosine phosphorylase. ROS ja tyrosiinifosforylaatiot
8. Swelling-induced ROS production: Role of NAD(P)H oxidase. Turpoamisen aiheuttama reaktiivisten happilajien tuotto. Mikä rooli on NAD(P)H oksidaasilla?
9. Lysophospholipids and release of organic osmolytes . Lysofosfolipidit ja orgaanisten osmolyyttien vapautuminen.

Suomennan yksityiskohdasta PLA2.

On käynyt ilmi, että fosfolipaasi A2:n aktivoituminen ja siitä seuraava arakidonihapon mobilisoituminen ja oksidaatio 5-lipoxygenaasilla (5-LO) leukotrieeneiks i(LTs) ovat essentiellejä tapahtumia solun turpoamisen aiheuttamassatauriinin efflux -tien aktivaatiossa, mikä johtaa tauriinin ulosvuotoon solusta- osana solun tilavuuden korjausprosessia.

( Huom. kommenttina voi sanoa, että siihen aikaan kun Suomen kansa ei käyttänyt kasvisöljyjä ja täten ei ollut voinut ladata solutumakalvoihin ja solukalvoihin tarpeeksi arakidonihappoa (linolihappojohdannaista omega6 sarjasta), yleinen tauti Suomessa oli kaikenlainen turvotus kehossa, kehoelimissä ja ihossa. Minun nuoruudessani vasta tuli ensimmäiset Raision kasvismargariinit suuren polemiikin jälkeen rinnakkaiskäyttöön voin kanssa, mutta kesti vielä aikaa ennen kuin ilmestyi ruokaöljyjä).

PLA2-välitteinen fosfolipidien hydrolyysi vapaiksi rasvahapoiksi ja lysofosfolipideiksi on osoittautunut essentielliksi tapahtumaksi ihmisen verihiutaleissa (trombosyyteissä), jotta solun turpoaminen aiheuttaa osmolyyttien vapautumista. Samoin CHP100 neuroblastoma soluissa ja HeLa soluissa.

Vapaan rasvahapon (FFA) ja lysofosfolipidin tyyppi, mitä fysiologisessa tilanteessa muodostuu, riippuu siitä subsellulaarisesta asemasta ja substraattispesifisyydestä, mikä aktivoidulla PLA2:lla on.

PLA2-perheen funktionaalista profiilia on tutkittu. PLA2 jäsenet voidaan jaotella seuraaviin:

cPLA2 _ sytosolinen (cytosolic), Kalsiumjonista riippuva PL2.
sPLA2 _ sekretorinen ( secretory), kalsiumjonista riippuvainen PLA2.
iPLA2 _ itsenäinen (independent), kalsiumjonista riippumaton PLA2.
sn-2 PLA2 _Tällä PLA2: lla on huomattava spesifisyys lyhyisiin ja oksidoituneisiin ryhmiin fosfolipidin sn-2 asemassa.

cPLA2 omaa kolme isoformia:

cPLA2alfa, joka on klassinen, ryhmä IVA, 85 kDa
cPLA2beeta, ryhmä IVB, 110 kDa
cPLA2gamma, ryhmä IVC, 60 kDa
Homologia isoformien kesken on 30%.
Kaikilla kolmella isoformilla on kaksi katalyyttista domaania, lipaasi consensus motiivi N-terminaalisessa katalyyttisessä domaanissa.
PLA2beeta ja PLA2alfa omaavat kalsiumjonia sitovan domaanin (CaLB) N-terminaalisessa osassa. Se omaa sekvenssihomologiaa C2 alueessa esimerkiksii PKC entsyymin kanssa.
cPLA2alfa omaa caveoliinia sitovan motiivin C-terminaalissa.
cPLA2gamma on isoprenyloitu.
cPLA2alfa on reseptorisääteinen ja sitä aktivoi moni agonisti, joihin kuuluu hormoneita, kasvutekijöitä, sytokiineja ja endotoksiineja.

cPLA2:n katalyyttinen toiminta on kalsiumjonista riippumatonta, mutta submikromolaariset kalsiumjonipitoisuudet tarvitaan, jotta entsyymi translokoituisi sytosolista Golgin laitteeseen, endoplasmisesn retikulumiin ja perinukleaariseen kalvoon ja sitten asettuisi aloilleen intermediääriseen filamenttikomponenttiin, vimentiiniin.

cPLA2alfa sisältää fosforylaatioon useita consensus kohtia. Täyteen katalyyttiseen aktiivisuuteen vaaditaanMAPkinaasiperheen jäsenellä (ERK, p38) tapahtuva Seriinin505 fosforylaatio.
cPLA2alfa valitsee kohteekseen mieluiten koliinia polaarisena pääteryhmänä sisältävän fosfolipidin (kuten lesitiinin, PC) ja sn-2 asemassa sillä tulisi mieluiten olla monityydyttämätön rasvahappo (PUFA). Mutta sn-1 aseman rasvahapon laadulle cPLA2 alfa ei esitä erityisiä vaatimuksia.

sPLA2 ryhmässä on identifioitu useita pienimolekyylisiä jäseniä ja ne luokitellaan ryhmiin I, II, III, V, X, XII.
Ryhmän I sPLA2 tunnetaan funktioltaan ruoansulatusentsyyminä ( digestive enzyme).
sPLA2 sisältää N-terminaalisen erityssignaalipeptidin ( secretion signal peptide).
Hepariinia sitovia sPLA2 tyyppejä ovat ryhmä IIA, IID,V. Ne vuorovaikuttavat heparaanisulfaattiproteoglykaaniin, joka on ankkuroitunut solun pinnalla sijaitsevaan GPI molekyyliin ( glykosyylifosfatidyyli-inositoliin). Ne lasketaan caveolan alueella oleviksi. (Caveolat ovat pullon muotoisessti membraanissa solun sisäänpäin päin syventyviä muodostumia). Tai ne ovat internalisoituneita ja aiheuttavat rasvahappojen ja lysofosfolipidien mobilisoitumista caveolassa tai solunsisäisissä domaaneissa.
Voidaan ajatella, että sPLA2 voisi aktivoitua caveolan organisaation vaihdellessa kun solun turvotessa solukalvo alkaa aueta laskoksistaan tai kun sytoskeleton organisoituu uudestaan.

"Nonhepariininbinding s PLA2", sellainen sPLA2-tyyppi, joka ei sitoudu hepariiniin, toisaalta vaikuttaa suoraan plasmamembraanin ulompaan lehdykkään.

iPLA2-ryhmä käsittää beeta-isoformeja ( ryhmä VIA, 85- 88 kDa) ja gamma-isoformeja ( ryhmä VIB, 90 kDa).
Mutta iPLA2 ryhmäläisllä ei ole mitään vaatimuksia fosfolipidin sn-2 aseman rasvahapon tai polaarisen ryhmän suhteen.

iPLA2 (VIA) aktivaatio vaatii oligomerisaation tai neljä iPLA2 monomeeria, mikä käsittää ankyriinitoistoja ( 7- 8 monomeeria kohden).
iPLA2(VIA) ei sisällä yhtään ankyriinitoistoa, mutta co-terminaalisen peroxisome lokaalisaatiosignaalin.
Kaspaasi-3 pilkkoo iPLA2:n kohdasta Aspartaatti 183. Mutta lyhentynyt muoto, josta puuttuu suurin osa sen ensimmäistä ankyriinitoistoa, omaa kohonneen fosfolipidi- turnover-aktiivisuuden.
iPLA2 (VIA) omaa glysiinipitoisen, nukleotidia sitovan motiivin ja sen katalyyttistä aktiivisuutta suojaa ATP ja muut nukleotidit.
Reaktiiviset happilaji (ROS) stimuloivat iPLA2 aktiivisuuden.
On raportoitu, että iPLA2 osallistuu eikosanoidien synteesiin.
On myös esitetty, että iPLA2 saattanee vahvistaaendogeenisen cPLA2 funktiota tai että iPLA2 ja cPLA2 yhteistyössä vaikuttavat sellaisissa fosfolipidimikrodomaaneissaä, joissa on runsaasti arakidonihappoa.

On käytetty useita inhibiittoreita, kun on identifioitu mikä tyyppi PLA2 ryhmästä osallistuu turpoaman aiheuttamassa solusignaloinnissa.
Haiman sPLA2 blokeerautuu inhibiittoreista nimeltä RO 31-4493, RO 31- 4639 yhdisteet.

Arakidonihappoanalogi AACOCF3 on membraanin läpäisevä ja sitä on käytetty sitoutumaan tiukasti cPLA2 entsyymin aktiiviin kohtaan. jolloin entsyymin aktiivisuus laskee.

Bromoenolilaktoni (BEL) inhiboi iPLA2 isoformeja.

Ehrlichin solujen kyky säädellä soluvolyymiä osmoottisen altistuksen jälkeen on huonontunut enimainituista inhibiittoreista, muta vain osaksi inhiboitunut arakidonihappoanalogista, mikä viitaa siihen, että Ehrlichin solussa aktivoituu useita PLA2 entsyymityyppejä.

Tinel et al. ovat osoittaneet munuaismedullan kokoojaputkista myös samaa, että eri tyyppiset PLA2 entyymit osallistuvat volyymille herkkään signalointiin.

cPLA2alfa on sijoittautunut tasaisesti kautta Ehrlichin solujen, mutta MDCK soluissa lähinnä tumaan, samoin HeLa soluissa ja naudan endoteelisoluissa.

Ehrlichin soluissa alfa isoformi translokoituu tumaan hypotonisessa altistuksessa aivan ensi minuutteina, mutta gamma-isoformi ei tee sitä. Translokaatioprosessi ei vaadi MAP-kinaasivälitteistä fosforylaatiota eikä intaktia F-aktiini sytoskeletonia.

Koe-eläimen alveolaarisissa soluissa ja ehrlichin soluissa on osoitettu cPLA2alfa translokaatio tumakalvoon, kun on stimuloitu kalsiumjoni-ionoforeilla.

Käyttämällä kalsiumjonia mobilisoivia agonisteja on osoitettu, että cPLA2 entsyymin differentoiva kohdistautumismekanismi on intrasellulaarisen kalsiumpitoisuuden absoluuttisen amplitudin (funktio) ja solunsisäisen ic- kalsiumin konsentraation kohollaoloajan(elevation) keston (duration) funktio.
Tästä seuraa erilaiset kohdentumiset:
cPLA2 translokoituu Golgin laitteeseen, jos intrasellulaarinen kalsiumjonipitoisuus pysyy pitkään tasolla 100- 125 nM.
cPLA2 translokoituu endoplasmiseen retikulumiin ja perinukleaariseen membraaniin kun konsentraatiotaso on 210- 280 nM.
cPLA2 entsyymin kohdentumisessa on osallisena CaLB domaani.
Koska Ehrlihin solususpensiossa ei rekisteröidy mitään kalsiumjonisignalointia hypotonisen altistuksen jälkeen, oletetaan, että vallitseva solun intrasellulaarinen kalsiumjonipitoisuus on riittävä cPLA2alfan translokoitumiseen ja sitoutumiseen tumakalvoon.

Kytettäessä ensinmainittua inhibiittoria (RO 31- 4639) Ehrlichin soluissa ja HeLa soluissa tauriinin ulosvuoto( efflux) solusta on vähäisempi solunturvotustapauksessa.
Sitävastoin BEL, bromoenolilaktoni estää tauriinin volyymiherkän vapautumisen NIH3T3 solusita, muta sillä ei ole mitään vaikutusta HeLa-solujen taruiinin vaputumiseen.
Arakidonihappoanalogi AACOCF3 vähentää solun turvotuksen indusoimaa tauriinin ulosvuotoa solusta koe-eläimen aivokuoressa, mutta ei omaa mitään vaikutusta volyymiherkkään tauriinivuotoon NIH3T3 soluista (hiiren fibroblastesta).
Täten todetaan että useita PLA2 entsyymityyppejä on osallistumassa tähän soluturvotuksen aiheutamaan tauriinin effluxiin.

Jos lisätään exogeeniä melittiiniä ja aktivoidaan tällä sPLA2, on voitu indusoida tauriinin vapautuminen NIH3T3 fibroblasteista isotonisissa olosuhteissa sellaisella prosessilla, joka käsittää saman solusignaalisysteemin ja tauriinin kuljetussysteemin, mitä on havaittu hypotonisen altistuksen jälkeen.

Arakidonihappoanalogi kuitenkin alentaa mellitiini/sPLA2 indusoitua tauriinieffluxia NIH3T3 soluissa. Koska sPLA2 aktiivisuus ilmeisesti riippuu aktiivista cPLA2- entsyymistä, on ehdotettu, että iPLA2, cPLA2 ja sPLA2 kaikki kolme säätelevät tauriinin vapautumista NIH3T3 fibroblastisoluista.