RIKKIAINEENVAIHDUNTA. Metioniini ja cysteiini , rikkipitoiset aminohapot (2007)

RIKKIAINEENVAIHDUNTA (suomennosta)

LÄHDE:  https://nutritionandmetabolism.biomedcentral.com/articles/10.1186/1743-7075-4-24

HUOM: tämä artikkeli ei käsittele rikkiaineenvaihdunnan tauriini-tietä. Tauriini on luonnollisesti normaalipitoisuudessa jos koko tämä rikkiaineenvaihdunta toimii ja se on näkymätön vitaali normaliteetti, jota yleensä ei mitenkään  katsota laboratoriokokeissa.

Tämä rikin käsittely lähinnä kohdistaa huomiota  mm.  nivelten kuntoon. Tauriini taas hoitaa solutason tilavuuksia.( Tanskal. Lambert)

Saammeko ravinnostamme tarpeeksi rikkiä?

Marcel E NimniEmail author, Bo Han and Fabiola Cordoba Nutrition & Metabolism20074:24 DOI: 10.1186/1743-7075-4-24 ©  Nimni et al; licensee BioMed Central Ltd. 2007 Received: 08 May 2007 Accepted: 06 November 2007 Published: 06 November 2007



• (1)  Tiivistelmän suomennosta

RIKKI, sulfur, on kalsiumin ja fosforin jälkeen kaikkein runsain mineraalialkuaine, jota kehosta löytyy. Rikki on meille saatavilla olevassa muodossa meidän ravinnossamme ja sitä tulee miltei yksinomaan proteiinista ja vain kahdesta aminohaposta jotka kuuluvat niihin kahteenkymmeneen kehorakenteemm proteiinien aminohappojen kirjoon

• Kehomme 20 rakenneaminohappoa ovat.
• glysiini, alaniini,
• valiini, leusiini, isoleusiini,
• seriini, treoniini,
• cysteiini, metioniini,
• aspartaatti, asparagiini, glutamiinihappo, glutamiini,
• arginiini, lysiini, histidiini
• proliini (hydroxyproliini)
• fenylalaniini, tyrosiini, tryptofaani

Näistä vain kaksi aminohappoa tuo kehoon orgaanista rikkiä: Cysteiini ja metioniini. Keho ei pysty tekemään emtioniinia ja sen takia sitä pitä tulla ravinnossa. Se on essentielli aminohappo. Sensijaan cysteiiniä voi kehon aineenvaihdunnassa muodostua tästä metioniinista käsin. Monia elämälle välttämättömiä avainaseamssa olevaia aineenvaihdunnallisia tuoteita voi kehossa muodostua, mutta prosessi vaatii jatkuvaa rikin saantia .

Valkuaisaineen rikkiä sisältävien aminohappojen pitoisuus on 3% - 6%. Hyvin pieni osa kehon rikistä tulee epäorgaanisista sulfaateista ja muista orgaanisen rikin muodoista, mitä elintarvikkeissa esiintyy kuten kynsilaukassa, sipulissa, parsakaalissa ym.

Essentiellien aminohappojen alin tarve (RDA) on aina tavattu arvioida typpitasapainon ylläpitämisen kannalta Tämä metodi määrittelee aminohappojen tarpeet proteiinisynteedin vaatimuksien mukaan, mikä taas on ravinnossa saatavan metioniinin kannalta vain yksi aineenvaihdunnallinen reitti sen monista reiteistä. Jota voisi asianmukaisesti arvioida metioniinin vähimmän tarpeen, pitäisi typpitasapainon ohella myös pitää yllä rikkitasapainoa – mitä ei koskaan lie suoritettu ihmisellä eikä eläimillä.

Tästä näkökulmasta tutkijaryhmä arvioi rikin saannin ravinnosta ( rikkiä sisältävinä aminohappoina) summittaisesti valitusta väestöstä ja suoritti rikkitasapainotutkimuksia rajoitetulta vapaaehtoisten joukolta. Aluksi tätä tehtiin yrittäen saada jotain informaatiota mahdollisesta rikkiä sisältävien yhdisteiden vaikutustavasta - näitä yhdisteitä olivat kondroitiinisulfaatti, glukosamioisulfaatti ym joita käytetään ravintolisinä niveltautien hoidossa. Tästä tutkimuksesta saatiin tieto, joka viittasi merkitsevän väestöosan (ikääntyneitä joukossa epäsuhtaisesti) saavan mahdollisesti riittämättömästi rikkiä ravinnossaan. Saatiin myös tieto, että nämä ravintolisät hyvin todennäköisesti ilmensivät farmakologisia vaikutuksiaan toimittamalla epäorgaanista rikkiä.Johdannon suomennosta. 

(2) Johdanto

Tutkijat päättivät syventää katsaustaan käsittämään laajemmin toisiaan kattavia aineenvaihdunnallisia teitä, jotka voisivat kärsiä riittämättömästä tai niukasta rikin saannista , sillä rikkiaineenvaihdunta on laajempisisältöinen kuin vain epäorgaanisen sulfaattin tie, ja rikki vaikuttaa monien avainasemassa olevien aineenvaihdunnallisten välituotteiden, esim. glutationin (GSH) synteesissä. Toivotaan, että aktsaus virittää jatkotutkimuksia jotka kohdistuvat tähän hyvin tärkeään, mutta usein hoitamatta jätettyyn, laiminlyötyyn aineenvaihdunnan alueeseen.

Rikkiä sisältäviä yhdisteitä, glutationi (GSH) avainasemassa, liittyy toiminnassaan moniin muihin yhdisteihin, joilla on suurta tehtävää hyvin kiintoisissa mekanismeissa perinteisen ja täydentävän lääketieteellisen hoidon osana. Näihin kuuluu omega3- ja omega6- monityydyttämättömät rasvahapot, mineraalit kuten seleeni, sinkki, kupari ja magnesium, E ja C vitamiinit, antioksidantit proantosyanidiinit ja liponihappo, joista monet osallistuvat prostaglandiinien synteesiin ja antioksidatiiviseen kaskadiin. Yhä runsaampaa näyttöä kertyy glutationin (GSH) ja muiden rikkiaineenvaihduntatuotteiden ko-operoivasta osuudesta näiden fundamentaalisten mekanismien homeostaattisessa kontrollissa.

(3)  Rikkiä sisältävien aminohappojen aineenvaihdunta.

Sekä yksimahaiset imettäväiset että linnut vaativat proteiinisyntesiinsä metioniinia ja cysteiiniä. Dieetissä täytyy olla näitä molempia metioniini ja kysteiiniä tai yksin metioniinia, jotta kasvu olisi normaalia. Cysteiinin fysiologisen tarpeen kattaa cysteiini tai dietäärinen metioniinilisä. Trans-sulfuraation molaarinen tehokkuus, siis metioniini-rikin muuttuminen cysteiini-rikiksi on 100%. Cysteiini voi alentaa ravinnossa tarvittavan metioniinin tarpeita, vaikka yhtään cysteiiniä ei muutu metioniiniksi korkeimmissa organismeissa – säästämällä sen hyödyntämistä essentielleihin prosesseihin. Dieettinäkökohdasta metioniini yksinään kykenee antamaan kaiken kehorikin, poikkeuksena on kaksi rikkipitoista vitamiinia, joita pitää saada ravinnossa. Nämä ovat tiamiini ja biotiini.

 

Vuonna 1989 US-FNB, NRC päivitti proteiinin ja aminohappojen ravintosusitukset (RDA). Nämä perustuivat typpitasaapinotutkimuksiin useita vuosia aikaisemmin. RDA aikuisten metioniinille ( metioniini + cysteiini) asetettiin 14 milligrammaan painokiloa kohden päivässä. Sen takia 70 kiloa painavalle henkilölle iästä ja sukupuolesta riippumatta tarvitaan päivän ravinnossa 1.1 grammaa (0.9 mMol) metioniinia ( metioniini+ cysteiini). Rosen ehdotus näistä määristä turvallinen saanti huomioon ottaen oli kaksinkertainen, 2.0 grammaa päivässä . Mahdollsesti tähän suositukseen johti se että tutkimuksiin oli osallistunut rajoitettu määrä yksilöitä, tavallisesti 3- 6 henkilöä yhden aminohapon selvittelyyn.

Nämä ihmisen metioniinitarpeet ja cysteiinin säästävä vaikutus - määritettynä nuorilta vapaaehtoisilta 1955 Rose et al. - työryhmän mukaan - pidetään vielä nykyään voimassa huolimatta viitteistä, että ne mahdollisesti eivät edustakaan universaalisia arvoja. Nämä vapaehtoiset olivat nuoria korkeakouluopiskelijoita. Tuttle et al. tekivät kokeensa vanhemmilla yksilöillä VA Hospital-sairaalassa Los Angelesin UCLA yliopistossa ja hän antoi puhdistettuja aminohappoja sisältävää dieettiä, jossa metioniinimäärät olivat vaihtelevia ja he päätyivät merkitsevästi suurempiin arvoihin kuin Rose et al. Kaikki kokeeseen osallistuneet tarvitsivat yli 2.1 g metioniinia päivässä, jotkut jopa 3.0 g metioniinia, jotta typpitasapaino olisi pysynyt positiivisena. 

 

Vaikka Fukagawa et al. eivät pystyneetkään vahvistamaan sellaisia eroja käyttämällä aminohappo-oksidaatiota pikemminkin kuin typpitasapainoa kriteerinä, he olivat kuitenkin sitä mieltä, että jatkotutkimuksia tarvittaisiin. Ei heidän tapansa lähestyä asiaa perustamalla isotoopilla rikastuneen hiilihdioksidin tuotantoon eikä myöskään typpitasapainoon perustuvat tutkimukset ottaneet huomioon rikkipitoisten aminohappojen ainutlaatuista osuutta sulfaatiorikin tuotossa. Fuller et Garlick tekivät katsauksen aiheesta yksityiskohtia myöten ja tulivat siihen johtopäätökseen, että sekä miesten että naisten aminohappotarpeet näyttävät aliarvioiduilta. 

 

Näin ollen näyttää välttämättömältä määritellä, onko rikintarpeet todellakin katetut, pitäähän rikkipitoisten aminohappojen (SAA) tuoda sulfaattia glukosaminoglykaanien (GAG) synteesiin ja erityisesti näitä GAG ja GSH esiintyy rustossa. Voi vain arvata, että GAG-synteesi ei liene hyvänlainen, jos metioniinin saanti on niukkaa, marginaalista ja arveltavasti keho priorisoi proteiinien synteesiä ja aineenvaihdunnan essentiellejä välituotteita : CoA, SAM (S-adenosyyli-L-metioniini), GSH jne. aivoissa ja muissa fundamentaaleissa elimissä. Niin vain on, että tästä tärkeästä pohdinta-aiheesta ei ole suoritettu tutkimuksia.

Ihmiskokeitten suoritus ei ole helppoa, ne ovat ekonomisesti vaativia ja monen variabelin vaikuttamia. Muilta lajeilta saa enemmän infomaatiota, erityisesti siipikarjalta ja muulta karjalta, missä kasvustimuluksella on huomattava ekonominen hyötynsä- Tässä huomautetaan, että siipikarjan rehuun lisätään aina metioniinia/cysteiiniä kasvun edistämiseksi. 

4. Tekijät, jotka voivat vähentää metioniinin ja cysteiinin saatavuutta.

SULFAATIO, sulfuroiminen, on päätie maksan suorittamassa farmakologisten aineitten myrkyttömäksi tekemisessä eli detoksikaatiossa Tietyt lääkeet, joilla on ruston poikkeavuuksissa hoidollista avainosaa (kuten asetaminofen) vaativat erittymiseensä sulfaattia. Asetaminofeniä on annettu aiemmin suurissa annoksissa kivun lievitykseen ja annoksissa mainitaan 4 grammaakin päivässä, jopa vielä enemmän joku käyttää. Tästä 35% erittyy sulfaattiin konjugoituneena ja 3 % cysteiiniin konjugoituneena. Loput erittyvät glukuronihappoon konjugoituneena, glukuronihappo on -ohimennen sanoen- GAG:ssa pääkomponentteja. (Huom Ruotsin asenne tähän lääkkeeseen: parasetamol http://www.lakartidningen.se/Functions/OldArticleView.aspx?articleId=11467) Ravintoon lisätty metioniini tai cysteiinim ( 0.5%) voi voittaa vaikean metioniinivajeen, joka koe-eläimissä on aiheutettu lisäämällä 1% acetaminofeniä ( parasetamolia) ( Ihmisellä tuo koe-eläinannos vastaisi 4 grammaa parasetamolia päivässä)- Mielenkiintoista on huomata, että sekä D-metioniini että L-metioniini pystyy palauttamaan kasvun, jos primäärivaje oli rikistä eikä proteiinisynteesistä johtuvaa. Mitä tärkeintä on, että maksan ”aktiivin sulfaatin” pitoisuus PAPS-muotoisena ( adenosiini-3´-fosfaatti-5´-fosfosulfaatti) on avainaseman aineenvaihdunnallinen edeltäjäaine glykosaminoglykaanille (GAG) ja sekin oli vähentynyt ja sen pitoisuus saatettiin kohottaa normaaliksi lisämetioniinia antamalla. Virtsan sulfaatin eritys oli alentunut jopa 95%, jos annettiin koe-eläimille metioniiniköyhää dieettiä ja samalla havaittiin että maksan metioniini laski 60%. Metioniinilisällä - riippuen vajeen korjaamisen asteesta - saatiin aikaan normaalia sulfaatin erittymistä ja maksan GSH-pitoisuutta. Epäorgaaninen sulfaatti ei ollut yhtä tehokas PAPS-pitoisuuksien kohottaja kuin metioniini ( orgaanista rikkiä antava aminohappo)( Kommenttini: tässä on myös muistettava että transsulfuraation apuna PAPS -molekyyliä eli ”aktiivia sulfaattia” muodostettaessa toimii K-vitamiini koentsyyminä ja B6-vitamiini säätelee negatiivisesti entsyymiä. Myös arylsulfataasien koentsyymi on K-vitamiini). Linkin yksinkertaistetusta kuvasta Fig.1 näkee, mikä suhde vallitsee rikkipitoisten aminohappojen (SAA), glykosaminoglykaanien ( GAG) synteesin, Glutationin (GSH) (cysteiinin varastoitumismuodon) , proteiinisynteesin ja typpiaineenvaihunnan kesken.

 On tutkittu  rikkiä  liian  vähän saaneita jyrsijöitä ja niissä tapahtuvaa parasetamolin (asetaminofen) detoksikoitumista eli sulfaatiota. Tarkoituksena oli, että katsottiin, minkälainen biologisen hajoamisen muuntuminen tapahtuu ”aktiivin sulfaatin” PAPS homeostaasissa, kun rikistä on vaje. Nämä eläimet eliminoivat asetaminofeniä verestään hitaammin ja se muuttui myrkylliseksi tioeetterivälituotteeksi. Alentuneen sulfaation katsottiin johtuneen epäorgaanisen fosfaatin alentuneesta saatavuudesta PAPS-synteesiin. 
 (Artikkelissa on yhteensä 12 kappaletta.)   Alkua suomennettu 9.4. 2016 

https://nutritionandmetabolism.biomedcentral.com/articles/10.1186/1743-7075-4-24
Tästä artikkelista otan joitain sitaatteja suomennettavaksi. Abastraktin ja
lopusta  Discussion- osa:

Abstract

Sulfur, after calcium and phosphorus, is the most abundant mineral element found in our body. It is available to us in our diets, derived almost exclusively from proteins, and yet only 2 of the 20 amino acids normally present in proteins contains sulfur. One of these amino acids, methionine, cannot be synthesized by our bodies and therefore has to be supplied by the diet. Cysteine, another sulfur containing amino acid, and a large number of key metabolic intermediates essential for life, are synthesized by us, but the process requires a steady supply of sulfur.

Proteins contain between 3 and 6% of sulfur amino acids. A very small percentage of sulfur comes in the form of inorganic sulfates and other forms of organic sulfur present in foods such as garlic, onion, broccoli, etc.

The minimal requirements (RDA) for all the essential amino acids have always been estimated in terms of their ability to maintain a nitrogen balance. This method asses amino acid requirements for protein synthesis, only one of the pathways that methionine follows after ingestion. To adequately evaluate the RDA for methionine, one should perform, together with a nitrogen balance a sulfur balance, something never done, neither in humans nor animals.

With this in mind we decided to evaluate the dietary intake of sulfur (as sulfur amino acids) in a random population and perform sulfur balance studies in a limited number of human volunteers. Initially this was done to try and gain some information on the possible mode of action of a variety of sulfur containing compounds (chondroitin sulfate, glucosamine sulfate, and others, ) used as dietary supplements to treat diseases of the joints. Out of this study came information that suggested that a significant proportion of the population that included disproportionally the aged, may not be receiving sufficient sulfur and that these dietary supplements, were very likely exhibiting their pharmacological actions by supplying inorganic sulfur.

Discussion

Glutathione (GSH) is the most abundant low molecular weight thiol and form of storage of SH-.

 Animal and human studies have demonstrated that adequate protein nutrition is crucial for the maintenance of GSH homeostasis [48].

 Elevated levels of GSH inhibit prostaglandin production by a direct interaction with COX enzymes, of potential significance in the progression of inflammatory or degenerative states [36]. 

 It is of particular interest, as discussed earlier that prostagandins synthesized from PUFA and most of the non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID)  share this same locus of involvement.

 It is also relevant that some recent studies have found that on occasions the pain reduction in OA associated with the administration of chondroitin sulfate, a source of sulfur, was found to be equivalent to that provided by NSAID. The reasons for such unpredictable results, we suspect could be associated with differences in levels of protein in the diet, the better responders consuming higher amounts of SAA. This hypothesis will have to be evaluated in future clinical studies.

As discussed neither cysteine nor methionine are stored in the body. Any dietary excess is readily oxidized to sulfate, excreted in the urine (or reabsorbed depending on dietary levels) or stored in the form of glutathione (GSH). Even in extreme situations, such as when tryptophane deficiency leads to a general catabolic effect, the organism tries to spare the loss of sulfur by continuing to store any available sulfur as GSH in the liver. GSH values are subnormal in a large number of wasting diseases and following certain medications, and by supplying SAA many of these changes can be reversed [49]. Whether dietary supplements containing sulfur display similar effects has not been evaluated systematically. Documented improvements in OA and joint pains associated with sulfurated water hydrotherapy, many times accompanied by the simultaneous ingestion of such waters has also been related to the GSH involvement in the antioxidant cascade.

In spite of the apparent complexity associated with evaluating the dietary intake of a population as a whole a pattern seems to emerge, even when evaluating small groups of individuals. In milk and dairy products the methionine/cysteine ratio is around 3/1. It is roughly the same in fishes such as canned tuna, which we used as a source of protein supplement in our studies, and in meats.  

In eggs, soy beans and other plant products it is around 4/3. The amount of protein in the various foods varies considerably, and the amount of SAA fluctuates. Chicken, fish and beef proteins contain an average of around 5% of SAA. Dairy products, milk, cheese, etc, contain lower levels, around 4%, primarily due to the lower content of SAA in casein. The whey protein fraction, accounts for about 20% of the milk proteins (rich in lactoglobulins) contains more SAA, and is used therapeutically or as a dietary supplement. Plant proteins, in addition to be present in lower amounts, are relatively low in SAA, averaging below 4%. The highest content of SAA is found in egg products, the egg white containing around 8% of SAA.

Consequently the ratios observed in a dietary survey will reflect the amounts of meats, eggs and plant products consumed. The amounts of protein, as a % of the calories consumed, is a major variable in the population. The more weight conscious individuals, and often the ones in more affluent societies, tend to consume less carbohydrate and fats and more proteins. This is counterbalanced some times by the tendency of many to consume less animal products and therefore to include more carbohydrates. In addition the desire to lose weight may reduce both calories and protein intake. Older people, at a time when OA becomes more prevalent, decrease their food intake often at the expense of proteins, frequently due to economic concerns.

Most individuals fall in between the groups established arbitrarily for the purpose of this study, but once a dietary pattern is established deviations are much less than expected. In our experimental studies, the levels of SAA were predetermined and individuals placed on pre-assigned diets containing known amounts of protein. This is critical, since even though the amounts of SAA intake closely reflects the rate of sulfate excretion, below a certain level of intake tubular reabsorption of sulfates prevents further loss. In rats, sulfate renal clearance was significantly decreased in animals that received a low methionine diet, a reflection of a sparing mechanism to retain sulfate [39]. A major unanswered question is how the overall caloric intake affects the requirements of sulfur used for other than protein synthetic purposes, and how long a sparing effect can continue during the prolonged intake of a low protein diet.

Any excess of SAA is oxidized to inorganic sulfate and excrete in the urine as neither organic nor inorganic excesses of sulfur can be stored. The normal concentration of sulfate in serum is around 3.5 mg/100 ml, roughly 5–10% of that as ether sulfate and the rest as sulfate ions. Sulfur is excreted in the urine as it exists in blood.

A deficiency of sulfur amino acids has been shown to compromise glutathione synthesis to a greater extent than protein synthesis in the presence and absence of inflammatory stimulus [34]. During an immune/inflammatory response a combination of enhanced utilization of cysteine for GSH synthesis and cell replication may be what leads to a depletion of cellular SAM.

In man serum fasting levels of inorganic sulfate were shown to increase with age and exhibit a circadian rhythm, probably associated with food intake. Genetic defects in sulfate transport have been associated with congenital osteochondrodystrophies that may be lethal and provide insights into sulfate transport and hormonal and nutritional regulation [50]. Whereas low levels of dietary protein led to hip joint displasia in mice and rats normal levels inhibited the development of OA.

Even though under normal circumstances dietary inorganic sulfate contributes very little to our sulfate pool, the exogenous administration of small amounts of sulfate in selected forms of delivery may be useful, since contrary to what is still a common belief sulfate can be absorbed form the GI tract [41, 51]. Along these lines the possible beneficial effects of inorganic sulfates in drinking water should be evaluated. Certain sulfur containing thermal water baths have been found to be of benefit, probably via transdermal penetration or because of actual drinking of such waters at health spas [21, 52–55].

On the other hand it is important to recollect that sulfation is a major pathway for detoxification of pharmacological agents by the liver. Drugs such as acetaminophen, so frequently used in the treatment of pain associated with joint diseases, require large amounts of sulfate for their excretion. Doses of up to 4 g/day are not infrequent. Thirty five % is excreted conjugated with sulfate, 3% conjugated with cysteine [12] and the rest conjugated with glucuronic acid, incidentally a major component of glycosamino glycans (GAG) which are so critical for the integrity of cartilage and other connective tissues.

Methionine or cysteine (0.5%) added to the diet can overcome the severe methionine deficiency induced in rats by the addition of 1% acetaminophen, an equivalent to the 4 g/day of the human dose. D- as well as L-methionine were found to be equally effective, suggesting that depletion of sulfur was at the root of the primary defect and that it was unrelated to protein synthesis. It is well known that N-acetyl-p-benzoquinoneimine, a toxic metabolite of acetaminophen is detoxified by hepatic GSH. Rapid administration of acetyl-cysteine to restore GSH levels remains the treatment of choice following acetaminophen poisoning. Hepatic concentrations of active sulfate, in the form of PAPS (adenosine-3'-phosphate 5'-phosphosulfate) were also decreased and could be restored to normal by supplementation with methionine [13].

The effectiveness of D-methionine in this connection brings back to mind the early studies of Rose who used DL-methionine in his early balance studies which led to the RDA recommendations, again suggesting a significant role for the SAA, beyond that of protein synthesis. That cysteine, sulfite and other sources of sulfates can serve as precursors for GAG synthesis has been well established [56–58]. Also restricting the availability of dietary sulfur in rats (cysteine, sulfate) decreased the biotransformation of acetaminophen, as a consequence of the absence of inorganic sulfate for PAPS synthesis [13, 15]. Consequently, addition of a sulfur containing compound to medications such as acetaminophen or catabolic agents such as the corticosteroids, may be a potential way to compensate for sulfur loss.

A major question that arises in connection with dietary supplements that provide organic forms of sulfur, is whether the diet could account for differences in response amongst individuals. It is possible that the individuals that benefit mostly from these supplements are those that consume inadequate amounts of protein or other sources of dietary sulfate. A recent publication by Drogue [59, 60], who has extensively investigated the relationship of oxidative stress and aging, has concluded that this event may be in great part be associated with a deficit of cysteine and to a suboptimal intake of SAA.

Finally it may be relevant to conclude this review with a statement taken from Sir Stanley Davidson and Passmore's classic textbook of Human Nutrition and Dietetics [61] who suggested that" it is not unlikely that some of the effects of protein deficiency are in fact due to failure of sulfur containing intermediates or even to sulfur containing polysaccharides. It is even possible that the ancient nostrum of 'brimstone and treacle' (sulfur and molasses) had nutritional value unsuspected by modern knowledge".